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            霉菌毒素對腸道緊密連接蛋白的影響及其調控機制

            時間:2020-09-30    點擊:675

            霉菌毒素是由曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌屬的絲狀真菌產生的有毒代謝產物,通常存在于谷物和新鮮蔬菜中。據估計,全世界1/4的糧食會受到霉菌毒素的污染。由于全球范圍內大量農產品受到污染,且有研究顯示霉菌毒素在食品和飼料中的含量仍在不斷上升,因此食物攝入被認為是人類暴露于霉菌毒素的主要途徑,由此所引發的健康問題不容小覷,日益引起人們的關注。根據毒理學數據顯示,玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬菌素(FBs)、黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素A(OTA)、脫 氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等被認為是最重要的霉菌毒素。


            腸道作為第一個接觸食物污染物的組織,被認為是霉菌毒素作用的靶器官。越來越多的研究表明,腸道上皮經常被霉菌毒素污染,且濃度高于其他組織。之前的研究揭示了腸道緊密連接(TJ)在維持腸道屏障功能中的重要性,因此當腸道TJ發生功能障礙時,會大大增加機體暴露于外源性化學物質和病原菌的幾率,從而引起腸道炎癥的發生。霉菌毒素通過改變腸道TJ蛋白的表達水平、定位,導致腸道機械屏障功能受損,從而誘導腸道功能損傷和腸道炎癥等疾病的發生;谀c道TJ蛋白在維持腸道屏障功能中發揮的重要作用,本文就霉菌毒素對腸道TJ蛋白產生的影響及作用機制進行綜述。



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            腸道TJ蛋白概述

            腸道黏膜屏障由機械屏障、生物屏障和化學屏障組成,其中機械屏障是保護腸道免受病原體或有害物質侵襲腸道黏膜的關鍵,并為維持腸道上皮的選擇透過性及其屏障功能提供了結構基礎。腸道上皮與細胞間形成的完整連接構成了機械屏障的結構基礎,構成機械屏障結構基礎的細胞間連接方式主要包括TJ、黏附連接(adherens adherens junction)、橋粒(desmosome)以及縫隙連接(gap junction) (圖 1) ,其中TJ是最主要的連接方式。TJ附著在上皮細胞以維持其結構和細胞極性,從而維持上皮細胞的生物學和屏障功能。而霉菌毒素可以通過破壞腸道黏膜機械屏障的完整性來發揮毒性作用。TJ蛋白是構成腸道上皮機械屏障的重要組成部分,不僅能維持上皮屏障功能、阻止有害物質和病原體,而且能選擇性地調節營養物質、離子和水分進入體內。因此,TJ蛋白表達或分布的改變會破壞腸道屏障的通透性,從而影響腸道功能。TJ蛋白包括:1)跨膜蛋白,其胞外域跨過質膜并與相鄰細胞相互作用;2)胞質支架蛋白,其完全位于質膜的胞內側?缒J蛋白在腸道上皮細胞的頂外側膜上形成由咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudins)連接黏附分子(junctional adhesion molecule)和 Tricellulin 組成的水平屏障。胞質支架蛋白,例如帶狀閉合蛋白(zona occludens,ZOs),提供了跨膜TJ蛋白與肌動蛋白細胞骨架之間的直接聯系。研究表明,Occludin、Claudins和ZOs是最重要的3類TJ蛋白,在維持細胞形態和形成阻止病原體入侵的屏障方面發揮著重要的作用。


            Occludin是最早發現的TJ蛋白,是一種四聚體膜蛋白,具有4個跨膜結構域、2個細胞外環和1個細胞內環。它不僅在TJ的組裝、穩定性和屏障功能中發揮重要作用,而且具有轉移各種旁細胞位置的能力,從而改變上皮細胞的通透性,改變其屏障功能。有研究表明,腸道通透性受損與Occludin的蛋白表達量下降以及Occludin的蛋白移位有關。其中,Tamura等的研究結果表明,Occludin敲除小鼠的腸道旁細胞通透性會顯著增加。且有研究指出Occludin從TJ處進入細胞質囊泡是腸道屏障功能喪失的主要原因。Cani等研究表明,Occludin的蛋白表達量與異硫氰酸熒光素(FITC)從胃腸道向血液的轉運呈負相關,強調Occludin在維持屏障功能中的重要性。



            Claudins是四聚體膜蛋白,具有1個胞內和2個胞外環以及C端和N端胞質結構域。作為TJ的另一類重要組成蛋白,Claudins在腸道屏障功能中發揮了重要的作用;贑laudins之間的鏈形成,TJ建立了調節腸道上皮細胞間分子流動的閥門。并且,Claudins分子的胞外環與相鄰細胞發生相互作用,這些相互作用在細胞旁通路中為選擇性分子的通過制造了屏障或通道。腸道上皮完整性對于維持外部和內部環境之間的物理屏障至關重要,而霉菌毒素可以通過降低特定亞型Claudin-3和Claudin-4的蛋白表達量來破壞人結腸癌細胞(Caco-2)的機械屏障性能。進一步使用Claudin-1和Claudin-2敲除小鼠的研究證實了Claudins在腸道屏障形成和細胞旁滲透選擇性中發揮的關鍵作用。


            ZOs位于細胞質表面,共有3種類型:ZO-1、ZO-2和ZO-3,與ZO-2和ZO-3相比,ZO-1在腸道上皮細胞TJ的形成中發揮主要作用。根據序列分析,ZOs被歸類為膜相關的鳥苷激酶同系物(MAGUK)家族的成員,它們攜帶3個PDZ結構域、一個Src同源-3(SH3)結構域和一個與N端鳥苷酸激酶(GUK)同源區域的多域蛋白。這些多域結構為TJ提供了一個調節和維持TJ結構所必需的細胞內支架。此外,ZO-1是TJ和肌動蛋白細胞骨架之間的重要連接分子,是TJ發揮功能的重要組成成分。ZO-1的N端與許多TJ蛋白半區結合,C端與肌動蛋白的細胞骨架和細胞骨架相關蛋白相互作用。ZO-1敲除細胞雖然能形成正常的TJ結構同時不影響細胞通透性,但卻觀察到Occludin和Claudins等其他TJ蛋白對TJ的裝配存在明顯的延遲,這證實了ZO-1在TJ組裝調控中的重要作用。


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            霉菌毒素對腸道TJ蛋白的影響


            2.1 霉菌毒素對腸道TJ蛋白表達量的影響

            2.1.1 霉菌毒素對細胞模型中腸道TJ蛋白表達量的影響

            霉菌毒素對細胞模型中腸道TJ蛋白表達量的影響如表1所示。伏馬毒素B1(FB1)處理Caco-2細胞后,其對Caco-2細胞屏障的損傷程度隨著Claudin-3、Claudin-4和Occludin的mRNA表達量的顯著降低而加深;黃曲霉毒素B1(AFB1)在降低了Caco-2細胞跨上皮膜電阻(TEER)值的同時,3、10和30mmol/L的AFB1以濃度依賴的方式降低了Claudin-3和Occludin的mRNA表達量;OTA降低了Caco-2細胞中Claudin-3、Claudin-4和Occludin的mRNA表達量。McLaughlin等結果表明,OTA(100μmol/L)在顯著降低Caco-2細胞Claudin-3、Claudin-4的蛋白表達量的同時,顯著降低細胞的TEER值,并且指出這種屏障性能的降低與Claudin-3和Claudin-4的消失是同時發生的。雖然12 μmol/L黃曲霉毒素M1 (AFM1)對Caco-2細胞中Claudin-3、Claudin-4和ZO-1的蛋白表達量沒有顯著影響,但當相同濃度的AFM1和OTA(20 μmol/L)聯合處理后,會顯著降低Caco-2細胞的Claudin-3、Claudin-4和ZO-1的蛋白表達量。與此同時,大量研究表明DON可增加多種細胞的通透性并降低其TJ蛋白的表達量,從而損傷腸道屏障功能。1000 ng/mL DON處理豬空腸上皮細胞(IPEG-J2)24 h 后,Claudin-3的蛋白表達量降低,當濃度增加、處理時間延長(4000 ng/mL,48 h)后Claudin-1、Claudin-3、Claudin-4和Occludin的蛋白表達量均顯著 降低。用 2000 ng/mL DON處理IPEC-J2細胞48 h后,ZO-1的蛋白表達量顯著降低。而另一研究則表明,4 μmol/L DON處理IPEG-J2細胞12h后,細胞Claudin-1、Claudin-4和Occludin的mRNA表達量升高,而Claudin-3的mRNA表達量下降。


            霉菌毒素引起TJ蛋白mRNA表達量及蛋白表達量的變化并不完全一致。研究報道,在暴露于DON的Caco-2細胞中觀察到Claudin-3、Claudin-4、Occludin和ZO-1的mRNA表達量均升高,而蛋白表達量卻顯著降低。此外,1 μmol/L DON處理小鼠直腸癌細胞(CMT93-II)36h后,DON顯著降低了Claudin-4的mRNA表達量,蛋白表達量卻顯著降低。因此,推測TJ蛋白是DON的主要靶向蛋白,并且mRNA表達量升高被認為是蛋白表達量降低的一種補償機制。而且,有研究指出Claudins的蛋白表達量下降與Claudins的mRNA表達量升高有關,ZO-1的mRNA表達量升高與ZO-1蛋白表達量的降低有關?偠灾,霉菌毒素對TJ蛋白表達量的影響因細胞的種類、霉菌毒素的種類和濃度而異,但都對腸道屏障功能具有一定程度地損傷作用。


            2.1.2 霉菌毒素對動物模型中腸道TJ蛋白表達量的影響

            霉菌毒素對動物模型中腸道TJ蛋白表達量的影響如表2所示。大鼠暴露于ZEN(0.3~146.0mg/kg)后,空腸中Claudin-4和Occludin的mRNA表達量顯著下降。當用發霉的小麥配制的DON污染飼糧(3.5 mg/kg)飼喂仔豬后,發現仔豬腸道屏障和免疫功能明顯受損,且回腸中的TJ蛋白Claudin-3、Claudin-4和Occludin的mRNA表達量顯著下降。在另一項研究中,DON(2 mg/kg)顯著降低了仔豬空腸Claudin-3和回腸Claudin-4、ZO-1以及結腸Claudin-1的mRNA表達量。Alizadeh等的研究結果顯示,DON(0.28 mg/kg)會顯著降低生長豬空腸ZO-1和Occludin的mRNA表達量。當仔豬暴露于FB1污染的飼糧(3 mg/kg)后,FB1會顯著降低其回腸中Occludin的蛋白表達量。用AFB(218.1μg/kg)和FB1(592.1μg/kg)污染的飼糧飼喂斷奶仔豬后,仔豬空腸通透性增加、結構受損,且ZO-l的mRNA表達量顯著下降。但在其他研究中卻得到了矛盾的結果,Chen等研究表明,AFB1(1.5 mg/kg)在影響肉雞腸道屏障功能的基礎上,增加了空腸中Claudin-1和Claudin-2的mRNA表達量。此外,用DON污染的飼糧[(7.54±2.20)mg/kg]喂養肉雞會增加其空腸Claudin-5以及回腸Claudin-1、Claudin-5和ZO-l的表達量。且DON(0.28mg/kg)會顯著增加生長豬回腸Claudins以及回腸、結腸和盲腸中Occludin的mRNA表達量。而且,有研究表明,DON (25 mg/kg)顯著增加了小鼠小腸Claudin-2、Claudin-3和Claudin-4的mRNA表達量。針對上述所提到的DON對TJ蛋白表達量產生的不同影響,有研究指出出現這種差異性的原因之一是由不同TJ的表達方式以及其不同腸段對DON的敏感性差異和受試動物的差異造成的。



            2.2 霉菌毒素對腸道TJ蛋白定位的影響

            研究表明,霉菌毒素會顯著改變細胞及動物模型中腸道TJ蛋白原有的結構和定位。與對照組相比,AFM1+OT+ZEN組的Caco-2細胞中TJ結構受損,細胞連接松散,細胞間隙增寬,TJ蛋白數量幾乎低于檢測限。并且,OTA在增加腸道 通透性的同時,誘導Claudin-4在Caco-2細胞中的重新分布。Gao等研究表明,正常Caco-2細胞中Claudin-3、Claudin-4、Occludin和ZO-1定位于質膜且呈鵝卵石狀分布,而OTA和AFM1+OTA處理卻破壞了原有的鵝卵石結構的完整性。OTA和DON顯著破壞了Claudin-2在CMT93-Ⅱ細胞接觸中定位的完整性。此外,包曉宇使用AFM1和AFB1單獨或聯合處理Caco-2細胞48h后,細胞中TJ蛋白網格狀分布受到破壞,并出現一定程度的內化——由膜定位變為胞質定位。另一項研究用30 μmol/L的OTA處理24h后,信號分布不均,熒光強度減弱,且連接處出現破裂。當用DON(4.17 μmol/L)處理Caco-2細胞24h后,與對照組相比,DON破壞了Claudin-1、Claudin-3、Claudin-4、Occludin和ZO-1連續的帶狀結構,且所有TJ蛋白在細胞膜上均呈現不規則分布。而且,有研究表明低濃度AFM1(1~10 μg/kg)雖使Caco-2細胞TEER值具有降低的趨勢,但Occludin和ZO-1的亞細胞定位卻不受影響。除此之外,霉菌毒素還能改變動物腸道TJ 蛋白的分布和定位。CD-1小鼠暴露于單獨AFB1或AFM1后,回腸Claudin-1在細胞質內的分布增加,且部分細胞頂端膜上不再分布該蛋白,相鄰細胞間細胞側膜上分布也明顯減少,細胞間隙不清晰;在AFB1和AFM1聯合處理下,大量Claudin-1彌散在細胞質中,細胞膜上的分布明顯減少,網格狀屏障結構瓦解嚴重。當用DON(25 m/kg)灌胃雄性B6C3F1小鼠6h后,遠端小腸中Claudin-1、Claudin-2和Claudin-3呈現不規則分布,而結腸中Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3、Claudin-4和Occludin和ZO-1的TJ分布模式并未有明顯差異。



            2.3 霉菌毒素調控腸道TJ蛋白的相關作用機制

            研究指出,TJ蛋白的表達主要受幾種細胞內途徑調控(圖2),包括肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)。其中,MLCK途徑是調控腸道TJ蛋白最常見的途徑之一,也是通過多種外部刺激(例如細胞因子和病原體)調節TJ通透性的關鍵途徑。有研究表明,OTA通過活性氧/鈣離子介導的MLCK蛋白通路顯著降低了IPEC-J2細胞中TJ蛋白的表達量。ZEN通過p38MAPK和MLCK相關信號通路破壞了魚腸道中的TJ,并改變了TJ蛋白的表達量。MAPK主要負責細胞內信號通路,在上皮細胞的炎癥反應中發揮著重要作用,包括3個亞家族:p44/42細胞外信號調節激酶(ERK)、p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)。p44/42MAPK信號傳導可以通過上調或下調幾種TJ蛋白的表達量來調節腸上皮細胞間的旁細胞運輸,從而改變腸道的屏障功能。Gao等研究表明,p44/42MAPK的活化部分參與了AFM1和OTA單獨及聯合作用下誘導的TJ蛋白表達量的下降。而且有研究表明,DON誘導IPEC-J2細胞TEER值和Claudin-3的蛋白表達量的降低是由p44/42MAPK介導而造成。且DON誘導MAPK活化可以調節小腸上皮細胞系中Claudin-4的表達,ERK1/2磷酸化能調控CMT93-Ⅱ細胞Claudin-2的表達。此外,DON能夠迅速激活人以及豬腸道細胞系中ERK1/2和JNK,從而顯著降低Claudins的蛋白表達量,而抑制ERK1/2磷酸化可恢復分化的豬小腸上皮細胞(IPEC-1)細胞的屏障功能。另一項研究卻得到了矛盾的結果,暴露于DON的豬空腸及其外植體中ERK1/2、JNK和p38等MAPK卻未被顯著激活。這說明DON對不同系細胞產生毒性的作用機制可能存在差異,但均能表明腸上皮的TJ是DON的主要靶點之一,且DON改變TJ蛋白的表達量與腸道上皮屏障通透性增加密切相關。此外,有研究表明PKC在連接蛋白的調節中起到了重要的作用,并指出PKC可能是緩解由霉菌毒素引起的腸道屏障損傷潛在的治療靶點。Willis等根據PKC抑制試驗推測PKC通路可能部分誘導DON引起的Claudins蛋白表達量下降,且有研究證實了抑制PKCζ的活性可以緩解內皮生長因子引起的人視網膜微血管內皮細胞的TJ蛋白表達量的降低。


            除了上述通路外,一些研究已經發現氧化應激參與調節由細胞外刺激引起的TJ和腸道屏障功能。為了確定氧化應激與TJ破壞和腸道屏障功能障礙之間的關系,Wang等在IPEC-J2細胞中使用了活性氧(ROS)清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC),結果表明NAC顯著阻斷了OTA誘導的細胞通透性的增加,且有效抑制了OTA誘導的ZO-1蛋白表達量下降以及ZO-1和Occludin的重新分布。而且,另一項研究表明OTA介導的腸道屏障毒性是由于OTA降低了Claudin-3和Claudin-4的蛋白表達量,這種作用在ROS清除劑存在時會失效。還有研究指出DON破壞IPEC-1細胞的TJ蛋白與Toll樣受體2(TLR2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路調控有關。同時,蛋白質合成受到抑制也可能影響TJ蛋白的表達。Walle等研究證實DON主要通過抑制蛋白質的合成來降低Claudin-4的蛋白表達量,而且,也有研究表明DON可能通過抑制的蛋白質合成降低了IPEC-J2細胞中TJ蛋白的表達量。DON和蛋白質合成抑制劑試驗驗證了DON通過抑制蛋白質的合成來改變TJ蛋白的表達量,從而影響腸道屏障的通透性。


            2.4 TJ破壞對疾病的影響

            TJ蛋白表達的改變、完整性的破壞以及功能的紊亂會導致多種疾病的發生。霉菌毒素作為腸道TJ網絡的特異性干擾因子,可能參與炎癥性腸道疾病的發病機制。TJ引起的腸道屏障受損會導致黏膜發炎,并已被證實與各種慢性腸炎性疾病的發病機理相關。TJ蛋白作為腸道屏障最重要的功能元件之一,在主要的慢性腸炎性疾病中均觀察到TJ蛋白表達量的改變和TJ蛋白的重新分布。研究表明,壞死性小腸結腸炎與腸道通透性和Claudin-2的蛋白表達量增加有關。此外,TJ功能障礙與其他疾病有關,例如破壞與Claudins結合的ZO-2突變會引起膽道疾病。


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             小結


            作為腸道機械屏障的重要組成部分,TJ蛋白在維持腸道屏障功能中發揮了重要的作用。由于霉菌毒素的廣泛分布,對全世界的人類和動物的健康構成了嚴重的威脅。近年來,霉菌毒素對腸道屏障的影響特別是對TJ蛋白的損傷作用引起了廣泛的關注。之前對霉菌毒素的研究主要集中在肝臟毒性、腎臟毒性、基因毒性、致癌性等,但是對TJ蛋白及其損害腸道屏障完整性的研究仍然有限。由本文上述內容所述,TJ蛋白在基因水平上的表達量因霉菌毒素的種類和濃度以及細胞本身的種類而異,但都對腸道屏障功能具有一定程度地損傷作用。霉菌毒素主要通過MLCK、MAPK、PKC和氧化應激通路以及抑制蛋白質的合成來改變TJ蛋白在mRNA和蛋白水平的表達量,從而影響腸道屏障功能,其中,DON對不同系細胞和不同品種試驗動物TJ蛋白調控的作用機制存在差異。因此,針對不同種類的霉菌毒素和細胞/動物模型,應選擇不同的預防靶點來促進TJ蛋白相關的腸道屏障功能。


            就目前來說,霉菌毒素對腸道TJ損傷如對腸道TJ蛋白的調節相關的機制研究還較少,且大都集中于體外模型的研究,缺乏體內研究的相關數據。今后的研究重點應主要放在霉菌毒素對腸道TJ的機制研究上,可以結合使用組學技術評估相關蛋白及基因功能的變化,為降低和修復霉菌毒素所引起的腸道屏障損傷提供理論依據。此外,我們應該把霉菌毒素對腸道屏障以及TJ蛋白的影響納入霉菌毒素的總體風險評估中,為人類和動物的健康提供更大的保障。


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